Laboratorní metody výzkumu. proteinurie

Video: laboratorní studie: Hematologie

Malé množství bílkoviny se nacházejí v každodenním moči od zdravých jedinců. Nicméně, takové nízké koncentrace nelze detekovat běžnými výzkumných metod. Izolace většího množství bílkovin, pro něž konvenční kvalitativní testy k proteinu v moči kladné, označované jako proteinurie. Rozlišovat ledvin (true) a extrarenální (false) proteinurii. V renální proteinurie bílkovin v moči proniká přímo z krve v důsledku zvýšení jeho filtrování nebo snížení ledvin glomerulech tubulární reabsorpci.

Renální (true) proteinurie

Renální (true) proteinurie je funkční a organické. Nejčastěji pozorované po jeho druhu mezi funkčním renálním proteinurie:

- fyziologické proteinurie děti, které zmizí při teplotě 4 až 10 dní po narození a předčasně později;
- ortostatická albuminurie, která je typická pro děti ve věku 7-18 let a zobrazí se pouze ve svislé poloze těla;
- přechodné (mrtvice), albuminurie, které mohou být příčinou různých onemocnění trávicího ústrojí, těžkou anémii, popáleniny, poranění nebo fyziologických faktorů těžké cvičení, podchlazení, silné emoce, hojný, potraviny bohaté na bílkoviny a další.

Organická (ledvin) proteinurie je pozorována v důsledku průchodu proteinu z krevního řečiště prostřednictvím poškozených částí endotheliálních onemocnění glomerulární ledvin (glomerulonefritida, nefróza, nefrosklerózy, amyloidóza, nefropatie těhotenství), poruchy renální hemodynamiky (renální žilní hypertenze, hypoxie), trofické a toxické (včetně včetně léků) účinky na glomerulárních kapilárních stěn.

Extrarenální (false) proteinurie

Extrarenální (false) proteinurie, ve kterém zdroj bílkovin v moči je příměs leukocytů, erytrocytů, bakterií, urothelových buněk. pozorována při urologických onemocnění (urolitiázy, renální tuberkulóza, ledvin a nádorových močových cest, atd).

Stanovení proteinu v moči

Většina z kvalitativních a kvantitativních metod pro stanovení bílkoviny v moči na základě jeho koagulaci v objemu moči, nebo na rozhraní (a kyselé moči).

Mezi další kvalitativní metody pro stanovení v moči bedka nejrozšířenější standardizovaný test s kyselinou sulfosalicylovou a prstencovým vzorku Geller.

Standardizovaný test s kyselinou sulfasalitsilovoy se provádí následujícím způsobem. Obě trubky jsou nalije na 3 ml filtrované moči. Jeden z nich se přidá 6-8 kapek roztoku 20% kyseliny sulfasalitsilovoy. Na tmavém pozadí jsou porovnány obě zkumavky. Zakalení moči ve zkumavce s kyselinou sulfasalitsilovoy indikuje přítomnost proteinu. Před tím, než studie je třeba určit reakci moči, a v případě, že je alkalická, poté se okyselí s 2-3 kapkami 10% roztoku kyseliny octové.

Vzorek Geller na základě skutečnosti, že přítomnost bílkoviny v moči na rozhraní kyseliny dusičné a koagulaci moči dochází a zdá se bílý kruh. Ve zkumavce se nalije 2,1 ml 30% roztoku kyseliny dusičné a jemně navrstvena na stěně trubky je přesně stejné množství filtrované moči. Vzhled bílého kruhu na rozhraní dvou tekutin indikuje přítomnost bílkoviny v moči. Je třeba mít na paměti, že někdy bílý prstenec je vytvořen s velkým množstvím močové, ale na rozdíl od proteinu se zdá kroužek mírně nad hranici mezi dvěma tekutinami a rozpustí se za zahřívání [Pletnev NG 1987].

Kvantitativní metody se nejčastěji používají:

1) jednotný způsob Brandberg-Roberts-Stolnikova, navazující na prstencové vzorku Geller;
2) fotoelektrokolorimetrichesky způsob kvantitativního stanovení bílkovin v moči zákalu vytvořeného po přidání kyseliny sulfasalitsilovoy;
3) Test biuretu.

Protein Identification v moči zjednodušeného urychleného postupu se provádí kolorimetrickou metodou pomocí indikátoru papír, který je vyroben «Lachema» (Slovensko), «Albuphan», «Ames» (Anglie), «Albustix», «Boehringer» (Německo), «Comburtest» a další. Způsob se ponoří do moči speciální papír impregnovaný pás tetrabromfenolovym modré a citrátový pufr, který mění barvu ze žluté na modrou, v závislosti na obsahu bílkovin v moči. Koncentrace přibližné proteinu ve zkušebním moči byla stanovena standardní stupnice. Chcete-li získat správné výsledky, musí být splněny následující podmínky. pH moči, musí být v rámci 3,0-3,5- na příliš alkalické moči (pH 6,5) se získá falešně pozitivní výsledky, a při příliš kyselá moč (pH 3,0), - negativní chyby.

Papír musí být v kontaktu s zkoumaného močí ne delší, než je uvedeno v návodu, jinak test poskytne falešně pozitivní reakce. Ten je také pozorován, když je obsah v moči velkého množství hlenu. Citlivost různých druhů papíru a série mohou být různé, tak kvantitativní vyhodnocení bílkoviny v moči tímto způsobem by se mělo zacházet opatrně. Stanovení jeho množství v denní moči pomocí testovacího papíru nelze [Pletnev NG 1987]

Stanovení denního proteinurie

Existuje několik způsobů, jak určit množství proteinu uvolněného v moči za den. Nejjednodušší způsob je Brandberg -Robertsa-Stolnikova.

Metodika. 5-10 ml důkladně míchaného denní moči nasype se do trubice a na stěnách opatrně přidá 30% roztok kyseliny dusičné. V přítomnosti proteinu v moči v množství 0,033% (tj. 33 mg na 1 litr moči) v 2-3 minutách se objeví jemné, ale viditelný bílý kruh. Při nižší koncentraci negativního vzorku. Při vyšší obsah bílkovin v moči se stanoví podle množství moči opakované ředění s destilovanou vodou, až dokud nejsou vytvořeny kruh. Konečný trubice, ve kterých kruh je stále viditelný, koncentrace proteinu bude 0,033%. 0,033 vynásobením stupeň zředění moče, Obsah bílkoviny se stanoví v 1 litru neředěné moče v gramech. Potom se vypočte obsah proteinu v denní moči podle vzorce:

K = (x·-V) / 1000

kde K - množství proteinu v denní moči (g) - x - množství proteinu v 1 litru moči (g) - v - množství moči za den přidělené (ml).

Za normálních okolností, v průběhu dne, kdy moč se uvolní od 27 do 150 mg (v průměru 40 až 80 mg) proteinu.

Tento test umožňuje určit jen moči jemný proteiny (albumin). Přesnější kvantitativní metody (kolorimetrická metoda podle Kjeldahla et al.) Jsou poměrně složitá a vyžaduje speciální zařízení.

Renální proteinurie v moči albumin vyniknout, a to nejen, ale i jiné druhy bílkovin. Normální proteinogramma má následující procentní podíl (podle Seitz a kol, 1953).: Albuminy - 20%, &alfa-₁-globulin - 12% &alfa-₂-globulin - 17% &gama - globulin - 43% &beta - globulinů - 8%. Poměr albuminy se globulinů se liší podle různých onemocnění ledvin, tj. narušen kvantitativní poměr proteinových frakcí.

Nejběžnější způsoby uroproteinov frakcionace jsou následující: nasolení neutrální soli, elektroforetické frakcionace, imunologické metody (reakce podle Mancini radiální imunodifúze, imunoelektroforéza testu, pretsipitatsionny Imunoelektroforéza), chromatografie, gelová filtrace a ultracentrifugace.

Zavedení uroproteinov frakcionační metody založené na studium elektroforetické pohyblivosti, variabilita molekulové hmotnosti, velikosti a tvaru uroproteinov molekul, je možné přidělit specifické pro určité typy onemocnění proteinurie studie volný prostor jednotlivých plazmatických proteinů. V současné době jsou v moči více než 40 plazmatické proteiny, a to i v normální moči plazmatické bílkoviny 31 [Berggard, 1970].

selektivní proteinurie

V posledních letech se pojem selektivity proteinurie. V roce 1955, Hardwicke a Squire formulovali pojem „selektivní“ a „neselektivní“ proteinurie, určení, že filtrace plazmatické bílkoviny do moči se vztahuje na určitý vzor: čím vyšší je molekulová hmotnost proteinu vylučovaného močí, tím menší světlou výškou a nižší koncentrace v konečné moči. Proteinurie odpovídající této vzor je selektivní, na rozdíl od neselektivní, který je charakteristický pro zkreslení vzory odvozeny.

Detekce proteinu v moči s relativně vysokou molekulovou hmotností vykazuje nedostatek selektivity ledvin filtru a vyjádřila porážku. V těchto případech hovoříme o nízké selektivity proteinurie. Proto se v současné době rozšířené určujících proteinových frakcí moči za použití elektroforézy technik škrobu a polyakrylamidovém gelu. Výsledky těchto výzkumných metod lze soudit na selektivity proteinurie.

Podle V.S.Mahlinoy (1975), nejvíce oprávněné je určit selektivity proteinurie porovnáním vůlemi 6-7 jednotlivé proteiny krevní plazmy (albumin, traneferrina, &alfa-₂ - makroglobulinu, IgA, IgG, IgM) za použití přesné a specifické kvantitativní imunotesty reakci radiální imunodifuze podle Mancini a imunoelektroforéza test pretsipitalnogo imunoelektroforéza. Stupeň selektivity je určen index selektivity proteinurie, což představuje poměr referenčního a porovnávaných proteinů (albumin).

Studium odstupy jednotlivých plazmatických proteinů umožňuje získat spolehlivé informace o stavu filtrace bazální membrány ledvinových glomerulů. Spojení mezi povahou proteinů vylučovány močí a změny v glomerulární bazální membrány a je vyjádřena jako konstanta, která uroproteinogramme může nepřímo posoudit patofyziologické změny v glomerulech ledvin. Za normálních okolností je průměrná velikost pórů glomerulární bazální membráně je 2,9-4 ° nm, která může přeskočit proteinů, které mají molekulovou hmotnost až do 10⁴ (Mioglobulin, kyselá &alfa-₁ - glykoprotein, imunoglobulinové lehké řetězce, Fc a Fab - fragmenty IgG, albumin a transferin).

Glomerulonefritida, nefrotický syndrom, velikosti pórů, zvýšení v glomerulární bazální membrány a proto je bazální membrána stává propustnou k proteinovým molekulám velkých rozměrů a hmotnosti (ceruloplasminu, haptoglobin, IgG, IgA, a další.). V extrémním renální glomerulární poškození v moči se objeví obří molekuly, proteiny krevní plazmy (&alfa-₂-makroglobulin, IgM a &beta-₂-lipoprotein).

Definování moči proteinu spektrum, můžeme konstatovat, že primární lézí některých částí nefronu. Pro glomerulonefritida, zejména ovlivňuje glomerulární bazální membrány charakterizované přítomností v moči středních a proteinů. Pro pyelonefritidy, především vliv na bazální membránu tubulů charakteristických krupnomolekulyarnyh nepřítomnosti a v přítomnosti zvýšeného množství střední a nízké molekulové hmotnosti proteinů.

&beta-₂-mikroglobulin

Kromě dobře známých proteinů, jako je albumin, imunoglobuliny, lipoproteiny. fibrinogen, transferin, moč obsahuje plazmatické bílkoviny mikroproteiny, včetně klinického zájmu &beta-₂-mikroglobulinu otevřený Berggard a Bearn v roce 1968, které mají nízkou molekulovou hmotnost (relativní molekulovou hmotností 1800), se volně prochází glomerulu ledvin a téměř úplně reabsorbována v proximálním tubulu. To umožňuje použití kvantitativního vymezení &beta-₂-mikroglobulinu v krvi nebo moči pro stanovení glomerulární filtrace a renálního resorpční schopnost proteinů v proximálních tubulech.

Koncentrace proteinu v plazmě a moči byla stanovena radioimunotestem použitím standardní soubor «Phade-Bas &beta-₂-mikroiest »(společnost "Pharmasia", Švédsko). U zdravých jedinců je sérový obsahuje průměrně 1,7 mg / l (v rozmezí 0,6 až 3 mg / l) v moči - průměr 81 mg / l (maximálně 250 mg / l) &beta-₂-mikroglobulin. Přebytek moč v jeho nad 1000, ug / l - patologický jev. obsah &beta-₂-mikroglobulinu v krvi zvýšení onemocnění spojených s poruchou filtrace glomerulární, zejména při akutní a chronické glomerulonefritidy, polycystické onemocnění ledvin, nefroskleróza, diabetická nefropatie, akutní selhání ledvin.

soustředění &beta-₂-mikroglobulinu v moči je v chorob spojených s poruchou funkce reabsorbtsionnoy kanálku, což vede ke zvýšení jeho vylučování v moči v 10-50 krát, a to zejména v pyelonefritidy, chronické selhání ledvin, hnisavý intoxikace kol zvyšuje. Je příznačné, že na rozdíl od cystitidy ne pyelonefritidy pozorovaný nárůst koncentrace &beta-₂-mikroglobulinu v moči, která může být použita pro diferenciální diagnózu těchto onemocnění. Nicméně při interpretaci výsledků této studie by měly být za to, že jakékoliv zvýšení teploty je vždy doprovázeno zvýšením vylučování &beta-₂-mikroglobulinu v moči.

Průměrné krve a moči molekuly

Průměrná molekula (SM), jinak nazývané proteinové toxiny jsou látky s molekulovou hmotností 500-5000 daltonů. Jejich fyzická struktura není známa. Struktura CM se skládá z alespoň 30 peptidů: oxytocin, vasopresin, angiotensin, glukagon, adrenokortikotropní hormon (ACTH), atd. Nadměrného hromadění CM je pozorována s poklesem funkce ledvin a obsahu v krvi velkého počtu deformovaných proteinů a jejich metabolitů .. Mají různorodou biologickou aktivitu a neurotoxicity sekundární příčinu imunosuprese, sekundární anémie, inhibují biosyntézu erytropoéza proteinů a inhibují aktivitu mnoha enzymů, které narušují fáze zánětu.

Úroveň SM v testu krve a moči screeningu je určena, a také spektrofotometricky v ultrafialové vlnové oblasti 254 a 280 mm spektrofotometr CI-8B a dynamické spektrum s počítačového zpracování v rozsahu 220 až 335 nm vlnové délky ve stejné společnosti Beckman spektrometru , Během normální příjem obsahu CM krev, rovnající se 0,24 ± 0,02 USL. jednotky, a v moči. - 0312 ± 0,09 konv. u
Jako normální životnosti výrobku organismu, jsou odstraněny z normální noční glomerulární filtrací na 0,5% - 5% z využit jiný. Všechny frakce SM vystaveny tubulární reabsorpci.

Neplazmennye (tkáně) uroproteiny

Kromě toho, proteiny plazmy krve v moči může být neplazmennye (tkáně) proteiny. Podle Buxbaum a Franklin (1970), neplazmennye proteiny tvoří asi 2/3 všech moči a biocolloids uroproteinov významné části na patologické proteinurie. Tkáňové proteiny padají přímo do moči z ledviny nebo orgány jsou anatomicky spojeny s močových cest, nebo pádu z jiných orgánů a tkání do krve, a odtud přes bazální membrány ledvin glomerulárních - v moči. V posledně uvedeném případě je vylučování proteinu v moči odstranění tkáně dochází analogicky na plazmatické proteiny různých molekulových hmotností. Složení neplazmennyh uroproteinov velmi rozmanitá. Mezi nimi, glykoproteiny, hormony, antigeny, enzymy (enzymy).

Tkáňové proteiny v moči za použití obvyklých metod chemie bílkovin (ultracentrifugace, gelové chromatografie, elektroforéza, různá provedení), specifické odpovědi na hormony a enzymy a imunologickými metodami. Ten umožňuje také ke stanovení koncentrace neplazmennogo uroproteina v moči a v některých případech také znát tkáňových struktur, které se staly zdrojem jeho vzhledu. Základní metodou pro detekci proteinu v moči je neplazmennogo analýza imunodifúzní s antisérem získané imunizací experimentálních zvířat a lidské moči odstředí (adsorbovaná) v následném plazmatické proteiny.

Studie enzymů v krvi a moči

Při procesu onemocnění pozorovány hluboké poškození živých buněk, doprovázený uvolňováním intracelulárních enzymů do tekutinového prostředí těla. Enzimodiagnostika vychází z definice řady enzymů izolovaných z buněk poškozených orgánů a není typických pro sérum.
Výzkumné nefron lidí a zvířat ukázaly, že některé jeho části mají vysokou enzymatickou diferenciace, úzce souvisí s funkcí prováděných každým oddělení. V ledvinách glomerulech obsahuje relativně malý počet různých enzymů.

Ledvinných tubulů buňky, zejména proximální obsahovat maximální počet enzymů. Jejich vysoká aktivita je pozorována v Henleovy kličky, rovných tubulů a sběrných kanálků. Změny v aktivitě některých enzymů v různých onemocnění ledvin závisí na způsobu povaha, závažnost a lokalizace. Jsou pozorovány před morfologické změny v ledvinách. Vzhledem k tomu, obsah různých enzymů jasně lokalizovaných v nefronu, definice určitého enzymu v moči může přispět k topické diagnóze patologického procesu v ledvinách (glomerulů, kanálky, kortikální a míchy), diferenciální diagnostice onemocnění ledvin a ke stanovení dynamiky (tlumení a exacerbaci) proces, při renální parenchym.

Délka diferenciální diagnostiku onemocnění urogenitálního systému se používá pro stanovení aktivity v krvi a moči z následujících enzymů: laktátdehydrogenázy (LDH), leucin aminopeptidázu (LAP), kyselé fosfatázy (AP), alkalická fosfatáza (ALP), &beta -. glukuronidázu, glutamát-oxalacetát transaminázy (GSCHT), aldolasa transamidinase atd. Enzymová aktivita v séru a v moči byla stanovena biochemickými, spektrofotometricky, chromatografických, fluorimetrické a chemiluminiscenční metody.

Enzimuriya v onemocnění ledvin je výraznější a přirozené, než enzimemiya. To je zvláště silně exprimován v akutním stadiu onemocnění (akutní pyelonefritida, traumatu, nádor útlumu, myokardu ledvin, atd.). V těchto nemocí zjištěných transamidinase vysokou aktivitu, LDH, alkalickou fosfatázu a KF, hyaluronidáza, kolo a nespecifické enzymy, jako je GSCHT, kataláza [Polyantseva LR 1972].

Selektivní lokalizace enzymů v nefronu při detekci LAP a alkalické fosfatázy v moči lze s jistotou říci, akutních a chronických onemocnění ledvin (akutní selhání ledvin, renální tubulární nekróza, chronická glomerulonefritida) [Shemetov VD 1968]. Podle A.A.Karelina a L.R.Polyantsevoy (1965) transamidinase obsahuje pouze dva subjekty - ledvin a slinivky břišní. Je to mitochondriální enzym a ledvin v normálním krvi a moči chybí. V různých onemocnění ledvin transamidinase objeví v krvi a moči, a v pankreatických lézí - pouze v krvi.

Diferenční zkouška v diagnostice glomerulonefritida a pyelonefritida Krotkiewski (1963) považuje za aktivitu alkalické fosfatázy v moči, zvýšení, které je typičtější pro pyelonefritidy a diabetická glomeruloskleróza, než pro akutní a chronické nefritidy. Zvýšení dynamiky amilazemiya zároveň snižuje amylasuria může znamenat, nefrosklerózu a renální jizvení, LAP má největší hodnotu v patologické změny v glomerulech a prolamovaných tubulech ledvin, protože jeho koncentrace v těchto oblastech nefronu vyšší [Shepotinovsky VP a kol., 1980]. doporučená definice pro diagnostiku lupus nephritis &beta - glukuronidázy a CF [Privalenko MN a kol., 1974].

Při posuzování role enzimurii v diagnostice onemocnění ledvin by měli vzít v úvahu následující ustanovení. Enzymy, inherentně proteiny s nízkou molekulovou hmotností může procházet přes neporušenou glomerulů, vymezující tzv fyziologické enzimuriyu. Mezi tyto enzymy se neustále stanovena v moči &alfa - amylázy (relativní molekulová hmotnost 45 Ltd.) a uropepsin (relativní molekulová hmotnost 38000).

Spolu s enzymy o nízké molekulové hmotnosti v moči zdravých jedinců lze nalézt v malých koncentracích a dalších enzymů: laktát dehydrogenázy, aspartát a alaninaminotransferázy, alkalická fosfatáza, a KF, maltáza, aldolázy, lipázy, proteázy a různé peptidázy, sulfatázy, kataláza, ribonukleázy, peroxidáza [King Boyce 1963].

Vysokomolekulární enzymy s relativní molekulovou hmotností větší než 70000-100000, podle Richterich (1958) a Hess (1962), může pronikat do moči pouze v rozporu s glomerulární propustnosti filtru. Normální obsah enzymů v moči nevylučuje chorobný proces v ledvinách s močovodu okluze. Když epzimurii možné výstupní enzymy, které nejsou jen ze samotných ledvinách, ale také z jiných parenchymálních orgánů, sliznic buněk močového traktu, prostaty a moči vytvořeny prvky s hematurie nebo leukocyturia.

Většina enzymů nespecificky ve vztahu k ledvinách, tedy odkud enzymů nalezených zdravé a nemocné v moči, je obtížné stanovit. Nicméně, míra enzimurii i délku než specifických enzymů při onemocnění ledvin je vyšší, než je obvyklé, nebo ten, který je pozorován u onemocnění jiných orgánů. Další cenné informace mohou poskytnout komplexní studii dynamiky řady enzymů, zejména orgán specifické, jako transaminázy.

Při řešení problému ledvinového původu enzymu v moči pomáhá ke studiu izoenzymy v identifikaci frakcí, které jsou typické pro studované orgánu. Izoenzymů - to enzymy působením izogenní (katalyzují stejnou reakci), ale heterogenní chemickou strukturou a dalších vlastností. Každá textilie má charakteristický pro její izoenzymem spektra. Cenné isoenzymů separační techniky elektroforézy na škrobové a polyakrylamidovém gelu a iontoměničovou chromatografií.

Bence-Jonesova proteinu

U mnohočetného myelomu a Waldenstromovu makroglobulinemii v moči detekován protein Bence Jones. Způsob detekce uvedeného proteinu v moči je založen na termopretsipitatsii reakci. Dříve používané metody, kterými rozpuštění proteinu se hodnotí při teplotě 100 ° C a srážením s následným ochlazením, nespolehlivé, protože ne všechny proteinové těla Bence Jones mají vhodné vlastnosti.

Více spolehlivá detekce paraproteinu vysrážením to při teplotě 40 -60 ° C, Nicméně, v těchto depozičních podmínkách nemůže nastat příliš kyselé (pH < 3,0—3,5) или слишком щелочной (рН > 6,5) моче, при низкой ОПМ и низкой концентрации белка Бенс-Джонса. Наиболее благоприятные условия для его осаждения обеспечивает методика, предложенная Patnem: 4 мл профильтрованной мочи смешивают с 1 мл 2 М ацетатного буфера рН 4,9 и согревают 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белка Бенс-Джонса в течение первых 2 мин появляется выраженный осадок.

Může-li se koncentrace proteinu Bence Jones menší než 3 g / l vzorku být negativní, ale v praxi je velmi vzácné, protože jeho koncentrace v moči je obvykle významnější. Na základě testu s vařením nelze zcela spoléhat. S jistotou, že může být detekován v moči imuno-elektroforetické metody za použití specifických antisér proti těžkých a lehkých imunoglobulinových řetězců.

NA Lopatkin

Sdílet na sociálních sítích:

Podobné