Metody pro izolaci polyribosomes. Rozměry polyribosomes syntetizovat protilátky

V současné době, zvýrazněte polyribosomes z lymfatické tkáně a myelomu nádory obvykle používat jejich homogenizace v Tris pufru roztocích (pH 7,0 až 7,6), s obsahem sacharózy, KCl (nebo méně - NaCl), MgCl 2 (nebo octanu hořečnatého) a některého z inhibitoru RNázy (častěji - heparin). Předpokladem je použití činidel, které neobsahují žádné RNase. První odstraněn z homogenátu jádra a mitochondrií postmitochondrial supernatant byl přidán do některého z detergentu (deoxycholát sodný nebo Triton X-100) se rozpustí enodoplazmaticheskogo retikula membránu a vysráží polirobosomy (nebo frakcionovaný) v kroku (0,5-1,5 M) nebo lineární (obvykle 15 až 30% roztok), sacharózy gradienty. Výtěžek poliribosomnogo materiál je v tomto případě 30-50% všech buněčných ribozomů.

Stupeň narození polyribosomes, získané z různých zdrojů, vliv na koncentrace sacharózy, iontová síla a pH poměru tlumivého roztoku se používá K / Mg a povahu detergentu. Tak polyribosomes ze sleziny výhodné používat Triton X-100, stejně jako v přítomnosti deoxycholátu sodného vyznačují degradaci. V některých případech se také doporučuje přídavek malých množství SaS12 nebo spermidinu zvyšujících stabilitu buněčných jader (Goryunova et al., 1974- stěnu např. A., 1977), a 2-merkaptoethanolu (Schechter, 1973). V zájmu snížení doby kontaktu polyribosomes z buněčného lyzátu se může také přímo aplikovat na buňky obsahující detergentní inhibitor nalaminovanou přímo na sacharózovém gradientu. V tomto případě, v průběhu odstřeďování kletkp současně lyžovány a frakcionované (Davis např. A., 1969).

Mělo by být poznamenáno, že izolaci nativní polyribosomes buňky z lymfatických tkáních normálních nebo imunizovaného živočišné tkáně je mnohem složitější a méně rozvinuté postup než jejich oddělení od plasmacytomy. Možná, že je to způsobeno tím, že je endogenní inhibitor RNasy plazmocytom, zatímco ve slezině a lymfatických uzlinách, tomu tak není, a RNázová aktivita v imunizaci ještě zvyšuje.

podstatný role, zřejmě hraje druh zvířete. Nejpříznivější objekty, údaje řádek jsou sleziny a lymfatické uzliny z krysy, ze kterých je možné získat nativní polyribosomes, sedimentaci v 250-350S a 160-190S obsahující aktivní pulsu a značku aminokyselin (Vassalli, 1967- Vasil et al., 1969). Existují také zprávy o přidělení nativních polyribosomes ze sleziny králíků (Becker, Rich, 1966- Scharff, Uhr, 1965) a morčat (Nikolaeva, 1976). Vzhledem k tomu, nádorové tkáně nejbohatším zdrojem polyribosomes jsou mielomy- lymfomy v menším počtu těchto organel (Sherr, Uhr, 1971a).

Výsledkem je, že zlepšení frakcionace technika lymfatické tkáně zvířat buňky a myší plasmacytomy podařilo izolovat širokou škálu polyribosomes se sedimentační konstantou od 118s až 350S. Bylo prokázáno, že množství imunizace polyribosomes a půl až dvakrát zvyšuje (Moav, Harris, 1970- YUrin, 1971), a jejich specifické distribuce stává dvoufázovou povahu. Podobné údaje o myelomových buněk byly získány Schubert (Schubert, 1968) a kontakt (Sidorov et al., 1973).

To bylo navrhl, že bifázická distribuce polyribosomes, značené rostoucích polypeptidových řetězců odráží přítomnost dvou tříd polyribosomes zapojených do syntézy H- a L řetězce. Imunoprecipitační experimenty s polyribosomes antiséra H a L řetězce bylo skutečně prokázáno, že H-řetězec detekovány pouze na polyribosomes 270-300S, a L-řetězec - s výhodou na polyribosomes 180-190S (Shapiro ea, 1966a- Askonas Williamson, 1967b ). Podle výpočtů prováděných autory, by měly tyto polyribosomes obsahovat mRNA, která se skládá z přibližně 1250 a 500 nukleotidy, např. E. velmi vhodné pro kódování syntézu H- a L řetězce.

Data získaná Dva zásadně důležité závěry, a to: 1) syntéza imunoglobulinů je monotsistronnyi povaha a 2) velikost polyribosomes a mRNA se podílejí na tvorbě H- a L řetězce, jsou dostatečné pro zakódování syntézy každého z nich jako celku.